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一种全新的在线监测葡萄糖和乳酸的技术
动物细胞分批补料培养工艺被广泛应用于生物制药的诸多领域，包括抗体药、AAV、CAR-T等。
一种全新的在线监测葡萄糖和乳酸的技术
2023-04-24
动物细胞分批补料培养工艺被广泛应用于生物制药的诸多领域，包括抗体药、AAV、CAR-T等。培养工艺的开发对于表达量、细胞生存能力和产品的质量都有很大的影响。补料或者灌流的优势在于可以不断地更新培养基的各种营养成分，补料策略（补料的时间，补料培养基的组成、总补料量）的优化一般可以增加细胞表达量、维持细胞高活力和生产专一性强的产品、延长培养周期。目前已开发了各种过程分析技术（PAT），以便在培养动物细胞的过程中以方便快捷的方式监测整个代谢过程并达到控制质量的目的。
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目前为止，许多参数都可以实现实时监测和控制，例如转速、pH、DO。而一些离线参数例如活细胞密度VCD、渗透压，代谢产物如葡萄糖、乳酸、铵离子则可以通过人工取样，离线检验获取。
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尽管一些重要参数的离线检验技术已非常成熟，但过多的手动取样除了带来更高的污染风险和劳动成本以外，对于一些需要高频次采样分析或者需要对细胞培养过程有更深层次的理解，再或者需要严格控制参数的情况而言，非实时结果的离线检测就不适用了。
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针对这类情况，目前许多企业也在致力于开发一系列在线监测重要参数的手段，如Incyte Arc 智能活细胞密度监测传感器（Hamilton）可以实时在线测量溶液中的活细胞密度，近红外（NIR）、中红外（MIR）、拉曼光谱（Raman）和荧光光谱（Fluorescent）等光谱分析方法也在生物过程监测和控制方面取得了进展。
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对于常规的两种重要参数葡萄糖、乳酸的在线监测，美国908devices公司收购的德国Trace品牌提供了一种新的可能（图1）。
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图1:Trace传感器
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首先，Trace采用的技术原理主要是透析膜和生物（酶）传感器，其中nm孔径的选择性透析膜在确保罐内无菌环境与非严格无菌的运输缓冲液体系不交叉的情况下实现只透过葡萄糖和乳酸小分子，通过缓冲液的运输到达测量单元，达到不采样分析的效果。对于小体积的发酵/培养，这种不损失样品的采样方式在实现高频次采样的同时还降低了污染风险。目前使用Trace的反应器最小可以达到60ml。
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而Trace技术的另一个核心，测量单元，使用的生物（酶）传感器对分析物具有高度特异性，低浓度下依旧可以保持有效的测量精度。相比传统的酶膜传感器，拥有高达5000次检测寿命的传感器甚至无需低温储存，5-25℃保存即可。此外，校准可以自由设置，操作便捷，培养环境无大幅改变的情况下只需一日校准一次即可。
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选择性透析+生物传感器，使Trace在不消耗反应器内培养体积的情况下，实现了对于重要参数葡萄糖、乳酸的在线监测，而最高2分钟一次的测量频率，使得工艺上为了减少乳酸积累必须严格控制葡萄糖浓度成为了可能。
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Trace与常规离线生化分析仪的结果对比如下（图2、3、4）：
图2德国汉诺威大学：240 h 细胞fed-batch Trace在线监测 vs. YSI离线结果
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图3四通道平行发酵 Trace在线监测 vs.Nova离线结果(Amgen, USA)
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图4 17天细胞培养 Trace在线监测 vs. ABL800离线结果（Sartorius Stedim Biotech）
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可以看到，Trace在实现在线监测的前提下，其结果与常规离线生化分析仪采样测量的结果吻合度极高，这也印证了Trace在提供大量数据的情况下，依旧保有优秀的数据准确性。
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Trace的适用场景包括：
①试图保持低浓度的营养素/代谢物（如控制葡萄糖在较低浓度可有效减少乳酸积累）；
②在严格的范围或工艺参数内操作（例如，高环境敏感性的细胞）；
③试图在长时间内保持稳定的过程状态（例如灌流）；
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以下是Trace在适用场景成功应用的一个学术案例（Zhang A, et al.. Biotechnol Bioeng. 2015 Dec;112(12):2495-504）：
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在以往批次中因乳酸积累过高而影响了细胞活率的HEK 293培养过程，通过Trace技术的高频不采样分析，将葡萄糖浓度严格控制在0.2-0.5g/L（传统的离线采样不支持高频的分析），最终达成了更低的乳酸水平（图5），提高了细胞的生存能力，延长了培养时间，titer提高了32%（图6）。
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图5
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图6
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显然，结论是高采样频率下对葡萄糖和乳酸的控制带来的是更高效和更稳健的工艺过程。
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另外，除了测量技术上的创新，针对不同的反应器类型，Trace还提供多种探头可选，确保可以灵活运用于大多数上游系统（图7）。
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图7
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在生物制药领域，目前普遍还是采用传统的人工采样，对劳动力的需求大，人为操作也更容易引入误差，这对于质量控制而言是不利的，而现在随着企业/研究所对于在线监测技术的需求日益增加，生物行业也出现了大量更实用和更稳定的在线监测技术，在线监测VCD、TCD的电极，拉曼光谱（在线测量葡萄糖、谷氨酸、铵离子、乳酸、VCD和TCD）以及上述采用透析+生物传感器的Trace等，生物培养工艺可能即将迎来巨大的转变。也许很快，工程菌/细胞的培养/发酵都将会实现全自动的过程监测与控制，这对于PAT，对于最终的GMP生产而言，无疑是飞跃式的进步。
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