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【文献解读】CHO细胞补料分批培养中氨基酸和葡萄糖代谢对抗体产生和糖基化的影响
补料分批培养中国仓鼠卵巢（CHO）细胞是生物制药行业中最常用的IgG生产工艺。
【文献解读】CHO细胞补料分批培养中氨基酸和葡萄糖代谢对抗体产生和糖基化的影响
2023-07-28
补料分批培养中国仓鼠卵巢（CHO）细胞是生物制药行业中最常用的IgG生产工艺。氨基酸和葡萄糖消耗、细胞生长、代谢、抗体滴度和糖基化模式始终是上游工艺优化，特别是培养基优化过程中的主要问题。了解它们之间的相互关系可以为获得更高的免疫球蛋白G（IgG）滴度和更好地控制糖基化相关的产品质量提供见解。本文使用了两种产生IgG的细胞系研究了两种化学定义的培养基和补料的不同分批补料培养工艺。
实验方法
细胞系：CHO细胞系1030和4384（DHFR-）；
培养条件：5%CO2、37℃、200rpm；
接种前传代方式：
在接种补料分批培养物之前，以5 *105cells/mL的密度接种细胞进行2天传代或3 *105个cells/mL进行3天传代；
Fedbatch：细胞在500mL摇瓶中生长，初始培养体积为70mL，温度为37℃，5%CO2，转速为200rpm。在第5天，温度从37℃转变到33.5℃。当活率低于60%或在D14收获；
不同条件
①A+FA8（基础培养基A，补料FA，接种密度8*105cells/mL）从D2起每天补料一次FA（初始培养物体积的3.3%）。D5和D7将葡萄糖调节至8g/L，D9和D11将葡萄糖调整至10g/L；
②A+FA4（基础培养基A，补料FA，接种密度4*105cells/mL）补料策略与A+FA8一致，但在该过程中不需要添加葡萄糖；
③B+FB4（基础培养基B，饲料FB，以4 *105cells/mL的接种密度接种）在D2、D5、D7、D9和D11天补料FB（初始培养体积的10%）。对于1030细胞系，在D5将葡萄糖调节至6g/L，在D9和D11将葡萄糖调整至9g/L。对于4384细胞系，D9将葡萄糖调节至10g/L，其他与1030细胞系一致；
检测方法
1.活细胞密度（VCD）：Vi-cell XR（Beckman Coulter）；
2.葡萄糖、谷氨酰胺、乳酸、铵、谷氨酸、pH和渗透压：
Bioprofile 100plus（Nova BioMedical）；
3.IgG滴度：配备有蛋白质A生物传感器（ForteBio）的Octet QK384通过生物层干涉测量法测定；
4.氨基酸分析：用阳离子交换色谱法进行，然后进行柱后衍生和荧光检测；
5.纯化后IgG浓度：NanoDrop ND-1000（Thermo Scientific）；
6.IgG完整质量分析：（LC–MS）Dionex Ultimate 3000 RSLC系统；
7.IgG糖谱分析：使用GlykoPrep1 InstantABTM试剂盒（Prozyme）对IgG中的N-聚糖进行消化、标记和清除，使用配备有Ultimate 3000 RS荧光检测器（Dionex）和ACQUITY UPLC BEH Glycan 1.7mm，2.1150mm柱（Waters）的Dionex Ultimate 3000RSLC系统进行HPLC分析；
8.清液中的总蛋白质浓度：皮尔斯BCA蛋白质测定试剂盒（Thermo-scientific）；
实验结果
图1显示了两种细胞系1030和4384的不同上游培养过程对生长、代谢和IgG产生的影响。A+FA4和A+FA8细胞的生存能力略低于B+ FB4。与B+FB4相比，A+FA8导致更快的细胞生长。更具体地说，在图1A中，当对1030和4384细胞系使用B+FB4培养条件时，D11的峰值活细胞浓度分别约为5和15*106cells/mL。相反，1030和4384细胞系的A+FA8在D9的峰值活细胞密度分别约为15和20*106cells/mL。有趣的是，与B+FB4相比，A+ FA4对细胞生长没有表现出任何显著的改善。而与B+FB4相比，A+ FA4和A+FA8的存活率下降更早、更快（图1A）。对于1030或4384细胞系，由于高细胞密度和高特异性IgG生产力，导致A+FA8比其他条件IgG产量高得多（图1B）。
图1
由于补料差异，与B+FB4相比，A+FA8中的葡萄糖浓度波动水平更高。此外，非常明显的是，葡萄糖在A+FA4培养过程中大量积累（图1C）。降温后，收获时A+FA4中谷氨酰胺的积累达到3.5mM。此外，与B+FB4中的谷氨酰胺浓度约为0–1 mM相比，两种细胞系在A+ FA8培养物中喂养前的谷氨酰胺浓度均约为1–2 mM（图1D）。在整个过程中，A+FA8（约3-6 mM）中的谷氨酸在补料前通常保持在比B+FB4（大约2-4 mM）更高的浓度（图1E）。发现从D7到收获的平均比葡萄糖和谷氨酰胺消耗率在两种细胞系的A+FA8中通常高于B+FB4（图1D和E）。就副产物的形成而言，两种细胞系的A+FA8中乳酸的积累都高于B+FB4中的乳酸（图1F）。在A+FA4中，乳酸积累及其平均比生产率都特别高，这可能是由于该培养条件中的高葡萄糖浓度（图1F）。从D5到D11，两种细胞系的NH4+在A+FA8中的积累都低于在B+FB4中（图1G）。然而，在A+FA4中，在培养过程中，NH4+的积累从2 mM显著增加到10 mM，这也表明了平均NH4+比生产率特别高（图1G）。
图2展示了氨基酸和葡萄糖的浓度和比消耗率的差异。一般来说，在D5至D13，4384细胞系的氨基酸浓度在A+FA8中比在B+FB4中更稳定（图2A）。具体而言，在B+FB4中，氨基酸如Asp、Ser、Gly、Val、Met、Ile、Leu、Lys、Arg和所有芳香族氨基酸（Tyr、Phe、His和Trp）从D11起明显下降。然而，从D5到D13，Ala在A+FA8和B+FB4中都积累。在B+FB4中，除了D5、D9、D11和D13的Glu和Gln以及D11和D13的Cys、Val和芳香族氨基酸（Tyr、Phe、Trp）外，大多数氨基酸在D5、D9、D11和D13具有更高的浓度。有趣的是，特定的氨基酸消耗率在很大程度上取决于培养物中相应氨基酸的浓度。事实表明，在B+FB4中，从D5天到D13，特定氨基酸消耗率（Glu、Gln和Ala除外）更高。相反，从D5到D13，A+FA8中的比葡萄糖消耗率总是更高（图2B和C）。我们还发现，B+FB4在D9-D11的氨基酸比消耗率高于D5-D9和D11–D13。相反，A+FA8中氨基酸（除Glu、Gln、Ala、Cys、Tyr、HYP和ABU外）的比消耗率在D9-D11低于D5-D9和D11-13。此外，在B+FB4中，温度变化（D5）后，细胞培养过程中的比葡萄糖消耗量下降，但在A+ FA8中稳定。
图2
如图3所示，A+FA8和A+FA4导致相对未成熟的糖型组合（Man5/Man5、Man5/A1G0F和A1G0F/G0F）的量较低，但相对成熟的糖型结合（G0F/G1F、G1F/G1F或G0F/G2F和G1F/G2F）的数量高于B+ FB4。特别是，来自A+FA8的Man5/Man5组合低于所用分析方法的可检测水平。还注意到，在A+FA8和B+FB4中，4384细胞系比1030细胞系产生更多相对未成熟的糖型组合。在相同的培养条件下，4384细胞系比1030细胞系产生更多的Man5、G1F、G2F和G2FS1（图4）。然而，不管培养条件如何，1030细胞系比4384细胞系产生更多的Man7。此外，A+FA8培养物产生的Man5和A1G0F较少，但产生的G1F和G2F较多。
图3
图4
收集A+FA8和B+FB4 D2和D11的细胞颗粒用于蛋白质印迹分析。分析GnT1和UDP-GlcNAc转运蛋白的表达水平，目的是了解高尔基体中聚糖链延伸反应的第一步，在该反应中，UDP-Glc被转运到细胞器中，然后添加到Man5聚糖结构上。在图5中，GnTI在两个时间点的表达似乎与1030细胞系的培养条件无关。然而，在1030细胞系中可以观察到UDP-GlcNAc转运蛋白表达的明显差异。1030细胞系A+FA8在D2显示UDP-GlcNAc转运蛋白表达的基础水平，然后在D11降低50%。相反，1030细胞系B+FB4在D2显示出略低的水平，到D11显著增加（2倍）。无论培养条件如何，4384细胞系的GnT1和UDP-GlcNAc转运蛋白的表达谱都相似。另外还注意到，在两个时间点，B+FB4中的GnT1水平都低于A+FA8。
图5
实验结论
当从1030和4384细胞系的B+FB4过渡到A+FA8时，由于培养物中氨基酸浓度更平衡，葡萄糖消耗率更高，可以获得更快的细胞生长、更高的IVC和IgG产量以及更成熟的糖型。
当将B+FB4与A+FA8进行比较时，阳性的Ala比产量、较高的Ile和Leu比消耗率以及较高的Glu及其Pro、His和Arg比消耗率表明细胞具有较高的转氨活性，从而在B+ FB4培养物中有更多的中间体进入TCA循环。NH4+的高积累被认为会抑制细胞生长，与A+FA8相比，这可能是B+FB4的重要缺点之一。在极端情况下，在A+FA4中，由于细胞活动的营养供应不平衡，非常高的乳酸和NH4+浓度抑制了细胞生长。
Ser和Leu是B+FB4培养基中消耗率最高的两种氨基酸。Ser和Leu的快速消耗可归因于它们在所产生的抗体的氨基酸组成中的丰度。据报道，Arg对CHO DG44细胞培养中的mAb产生具有负面影响，其在A+FA8中的浓度低于B+FB4。在B+FB4中，比在A+ FA8中消耗更多的氨基酸进入分解代谢过程，以补充从葡萄糖中获得的能量。因此，IgG生产的原料可能较少，因此B+FB4中的特异性生产力可能会受到负面影响。
对于4384细胞系，Man5的积累可能是由于UDP-GlcNAc的可用性和GnT1的表达的瓶颈。β-1,2-N-乙酰葡萄糖胺转移酶Ⅰ(GnT1)是哺乳动物细胞糖蛋白N端糖链加工的关键酶之一，能催化糖链由甘露糖型向杂合型转变。4384细胞系被发现具有极低的细胞内UDP-GlcNAc浓度，图5中该细胞系在B+FB4的D2和D11都表现出较低的GnT1表达水平。与4384 A+FA8相比，4384 B+FB4积累的大量Man5，前者的低细胞内UDP-GlcNAc浓度可能是由于该核苷酸糖的低生物合成，而在4384 A+FA8中观察到的低UDP-GlcNAc浓度可能是由于该核苷酸糖的高消耗。B+FB4中UDP-GlcNAc的有限生物合成通过该培养条件中细胞外谷氨酰胺的低可用性得到证实（图1D）。据广泛报道，这种营养素的有限可用性限制了UDP-GlcNAc的生物合成。
而细胞系1030表现得相当不同。在B+FB4中，1030细胞系产生的Man5比A+ FA8多81.1%±3.5%，这与细胞内UDP-GlcNAc浓度数据形成了鲜明对比（图3）。因此，UDP-GlcNAc浓度可能不是该细胞系中糖基化处理的限制因素。如果核苷酸糖的消耗速率低于其产生速率，则可能发生高UDP-GlcNAc积累和高Man5分泌。UDP-GlcNAc消耗的减少可能归因于GnTI或UDP-Glc NAc转运蛋白的表达不足。然而，图5显示GnTI在细胞系1030的两种培养条件下以相似的水平表达，这表明酶的表达可能不是限制性的。通过该分析，UDP GlcNAc消耗减少的唯一剩余原因涉及GnTI或UDP GlcNAc转运蛋白的活性。另外还发现，该细胞系中细胞外氨的高积累与Man5的高分泌有关。先前的报道提出，氨的积累可能会增加高尔基体内的pH值，从而抑制糖基化酶的活性。也有报道称，高尔基体pH值的增加会导致糖基转移酶的错位。
实验结果表明，培养基中葡萄糖和氨基酸浓度的平衡对细胞生长、IgG滴度和N-糖基化很重要。由于细胞活动的营养供应不平衡，副产物如NH4+和乳酸的积累会抑制细胞生长。培养物中与细胞生长和IgG生产力有关的Leu和Arg水平需要得到很好的控制。具有最高消耗率的氨基酸与产生的IgG中存在的最丰富的氨基酸相关，因此在培养过程中需要足够的可用性。在某些情况下，Man5聚糖的存在可能与细胞外Gln不足导致的UDP-GlcNAc生物合成的限制有关。然而，在不同的培养条件下，高Man5水平也可能是由于低的GnTI和UDPGlcNAc转运蛋白活性，这可能归因于细胞培养中高水平的NH4+。个案分析对于理解培养基和工艺优化对糖基化的影响是必要的。培养基和工艺优化对糖基化的影响应该根据具体情况来理解，这是蛋白质加工速率、细胞代谢以及高尔基体驻留蛋白的表达和活性相互作用的结果。考虑到所涉及的机制的多样性，系统生物学方法在未来可能有助于理解蛋白质糖基化，并进一步帮助糖型控制的尝试。
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