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2025
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08
替尔泊肽检测方法开发
替尔泊肽作为胰高血糖素样肽-1（GLP-1）和葡萄糖依赖性促胰岛素释放肽（GIP）受体激动剂，是治疗2型糖尿病的有效药物，具有降血糖和减轻体重的作用。由于其临床价值和药理可靠性，GLP-1受体激动剂在全球制药领域占据着稳固的地位。因此，准确的质量控制至关重要，尤其是氨基酸序列和高级结构对治疗效果有重大影响。
本案例概述了替尔泊肽的方法分析开发过程。筛选方案评估了流动相中的pH值和有机溶剂、色谱柱温度、固定相以及生物惰性色谱柱硬件的影响。
化合物信息
名称：替尔泊肽
分子量：4813.45 Da
分子式：C225H348N48O68
结构：
色谱筛选条件
色谱柱：
YMC-Triart C18 (12nm, 1.9µm) 100 x 2.1mm ID
YMC-Triart C8 (12nm, 1.9µm) 100 x 2.1mm ID
YMC-Triart Bio C18 (30nm, 1.9µm) 100 x 2.1mm ID
流动相A：水溶液
流动相B：乙腈或者甲醇
梯度：1%B/min
流速：0.2ml/min
柱温：40℃，60℃
进样量：2µl
样品：替尔泊肽粗品（纯度20.5%）和标准品（浓度2.0mg/ml，溶剂20mM碳酸氢铵溶液）
检测波长：220nm
流动相不同PH的影响
色谱柱：YMC-Triart C18
流动相A：
0.1%三氟乙酸溶液（pH 2.0） / 0.1%甲酸溶液（pH 2.5）
20 mM乙酸铵溶液（pH 6.7） / 50 mM碳酸氢铵溶液（pH 8.0）
流动相B：乙腈或甲醇
柱温：40℃
结果显示，使用乙腈均能获得更好的峰型。采用中性至弱碱性流动相可显著提升分离效果，峰型更好。这可能是由于替尔泊肽在碱性溶液中具有良好的溶解性。乙酸铵和碳酸氢铵均有较好的分离效果，因此考虑用于进一步优化。
柱温的影响
将色谱柱温度从40℃提高到 60℃，可提高分辨率，峰宽更窄。（碳酸氢铵溶液不适用60℃柱温条件）
色谱柱的影响
色谱柱：
YMC-Triart C18 (12 nm, 1.9 µm) 100 x 2.1 mm ID
YMC-Triart C8 (12 nm, 1.9 µm) 100 x 2.1 mm ID
YMC-Triart Bio C18 (30 nm, 1.9 µm) 100 x 2.1 mm ID
实验结果显示，使用孔径更大的色谱柱YMC-Triart Bio C18，有利于替尔泊肽形成更好的峰型，从而更好的与后面的杂质峰分离。在乙酸铵条件下，其分离度明显提高，峰宽更窄。
生物惰性色谱柱的优势
在不同样品浓度下对生物惰性涂层色谱柱与常规不锈钢色谱柱进行对比，结果表明，使用生物惰性涂层的YMC Accura色谱柱可获得更高的峰面积和更好的峰型。推测是由于常规不锈钢色谱柱内壁存在非特异性吸附。
优化分析条件
通过进一步优化梯度斜率和有机溶剂比例
色谱柱：YMC Accura Triart Bio C18 (30 nm, 1.9 µm) 100 x 2.1 mm ID
流动相A：20mM 乙酸铵溶液（pH 6.7）
流动相B：乙腈
梯度：36 - 44 %B (0 - 16 min)，100 %B (16 - 20 min)
流速：0.2ml/min
柱温：60℃
进样量：2µl
样品：替尔泊肽粗品（纯度20.5%，2.0mg/ml）和
标准品（0.5mg/ml，溶剂DMSO）
检测波长：220nm
结论
本方法可稳定准确检测替尔泊肽的纯度。中性至弱碱性缓冲盐体系在高温条件下可获得较高的分离度和尖锐的峰型。此外，即使微量进样，采用YMC Accura Triart Bio C18生物惰性涂层色谱柱仍能改善峰型并提高回收率。该方案同样适用于其他GLP-1受体激动剂的方法开发，且满足药物分析法规要求。
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